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PCR技术基本原理

实验室资讯网 更新:2016-11-06 点击: 论坛讨论 百度搜索
【导读】PCR技术基本原理 类似于 DNA 的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性 -- 退火 -- 延伸三个基本反应步骤构成: 1、 模板 DNA 的变性:模板 DNA 经加热至 93 ℃ 左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之......
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 PCR技术基本原理

类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:

1、模板DNA的变性:模板DNA经加热至93左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

2、模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

3、引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的半保留复制链,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝.

PCR的反应动力学

 PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现停滞效应,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。

 

PCR反应体系的基本成分

模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶、dNTP Mg2+的缓冲液。

(来源:网络)

(责任编辑:子豪)

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